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      ELISA操作常見問題和解決方法
      來源:Genenode|君諾德公司     發(fā)布時間:2016-04-16     Hits:5149

      ELISA即酶聯(lián)免疫吸附實驗,是目前廣泛應用于各種抗原抗體檢測的方法,主要有靈敏度高和特異性強的特點。ELISA操作步驟看似簡單,整個測定過程中卻有諸多影響因素,導致檢測結果可能與實際結果偏差較大。為幫助大家分析實驗中常見問題,我們將常見問題的可能原因和解決方法歸納總結于下表:

       

      問題一:高背景或陰性對照值偏高

      可能原因

      建議

      陰性對照孔被陽性對照或樣品污染

      洗滌時,勿將洗液溢出孔外。

      洗滌不充分

      確保在洗滌時每個孔都充滿了液體,確保將殘余液體從孔中移除。

      酶結合物過濃

      請檢查酶結合物是否按說明書規(guī)定稀釋

      孵育溫度過高

      檢查孵育箱的溫度是否正確、穩(wěn)定

      底物在使用前曝光

      應保存在暗處,避光。

      讀板前停留時間過長

      加終止液后3分鐘內(nèi)讀數(shù)

       

      問題二:陽性對照值偏低或低吸光度

      可能原因

      建議

      蒸發(fā)

      各步之間,須使用封版膠密封反應板。

      溫度不均勻

      校準孵育箱,勿疊放反應板。

       

      問題三:邊緣效應

      可能原因

      建議

      蒸發(fā) 

      各步之間,須使用封版膠密封反應板

      溫度不均勻 

      校準孵育箱,勿疊放反應板

       

      問題四:標準曲線不佳 

      可能原因

      建議

      倍比稀釋標準品時未混勻 

      稀釋標準品的每一步均需混勻

      過早稀釋

      標準品在快要使用時稀釋

      加入的體積不正確

      使用校準過的移液器,快速、等量的將標準品分配到各個微孔中

       

      問題五:標準曲標準曲線良好,但樣本無檢測信號

      可能原因

      建議

      樣本中無檢測物或檢測物含量極低

      設置內(nèi)參,重新實驗

      樣本中其他物質(zhì)影響/掩蓋檢測

      作適當稀釋,降低其他物質(zhì)的干擾,或作系列稀釋,檢測回收率。

      樣本中檢測物濃度過高,Hook效應導致假低值

      適當倍數(shù)稀釋樣本,檢測物濃度盡量在試劑盒檢測范圍內(nèi)。

       

      問題六:重復性較差

      可能原因

      建議

      微孔中有氣泡

      用針尖挑破氣泡

      試劑未混勻

      確保充分混勻試劑

      樣本中有雜質(zhì)或沉淀物

      使用前離心

      微孔包被面被吸頭劃破

      加液時小心操作

      使用用過的封板膠紙

      每次須使用新的封板膠封住反應孔


      Genenode|君諾德公司

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