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污染向來(lái)是在細(xì)胞培養(yǎng)中的大問(wèn)題。預(yù)防或治理污染是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素。我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)時(shí)，在開(kāi)始階段就要十分重視污染問(wèn)題，否則會(huì)前功盡棄，這樣不僅浪費(fèi)時(shí)間，也會(huì)浪費(fèi)人力、物力。  

(一)  有哪幾類污染？
在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染不只是指微生物，而且還包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的、對(duì)細(xì)胞生存有害或造成細(xì)胞不純的物質(zhì)，包括生物和化學(xué)物質(zhì)。   

1、細(xì)菌污染
細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴?。最常?jiàn)的有革蘭氏陽(yáng)性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見(jiàn)。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。   

2、真菌污染
真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中最常見(jiàn)的一種，最常見(jiàn)的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見(jiàn)培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長(zhǎng)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見(jiàn)絲狀、管狀或樹(shù)枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。  
真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。

3、支原體污染
支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過(guò)濾除菌無(wú)法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開(kāi)始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對(duì)青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。  
培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無(wú)明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。   

4、病毒污染
組織細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，如果沒(méi)有除去潛在的病毒，就會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。   

5、非同種細(xì)胞污染
由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒(méi)有嚴(yán)格分開(kāi)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無(wú)效。  
  
細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。

（二）污染類型的區(qū)別
1、細(xì)菌、真菌污染的檢測(cè)
     (1)  肉眼觀察 ---- 細(xì)菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開(kāi)放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時(shí)內(nèi)可明顯觀察到，例如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。  
     (2)  接種觀察 ---- 用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。   
     (3)  鏡下觀察 ---- 倒置顯微鏡的高倍鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細(xì)菌污染。細(xì)胞之間有絲狀、管狀、樹(shù)枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。   

2、支原體污染的檢測(cè)
     (1)  相差顯微鏡觀察 ---- 接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間，有時(shí)可見(jiàn)類似于布朗運(yùn)動(dòng)的表現(xiàn)。
  注意與細(xì)胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。  
     (2)  熒光染色法觀察 ---- 熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。  
     (3)  電鏡檢測(cè) ---- 條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時(shí)，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。  
     (4)  培養(yǎng)檢測(cè) ---- 細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無(wú)霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無(wú)“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。  

3、病毒的檢測(cè)
   (1)  應(yīng)用電鏡技術(shù)快速診斷動(dòng)物病毒病  
    (2)  逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)RT_PCR檢測(cè)病毒   

（三）污染清除方法
 培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價(jià)值不大，宜棄之；在尋找原因后徹底消毒操作室，復(fù)蘇或重新購(gòu)置細(xì)胞，再培養(yǎng)。  
 污染細(xì)胞價(jià)值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。

1.細(xì)菌和真菌的清除
  抗生素對(duì)殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。  
  預(yù)防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。

2.支原體的清除
   (1)  用MRA處理 -----
用MRA（Mycoplasma Removal Agent）處理細(xì)胞，每4天換一次液,連續(xù)處理15天以確保細(xì)胞純潔健康，效果好。   
   (2)  用清洗純化法清除支原體污染的方法 -----
細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選→細(xì)胞清洗→反復(fù)離心洗滌。
其原理是利用離心力、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達(dá)到清除支原體的目的。由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生,所以通過(guò)反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至極限.
如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達(dá)到更好的效果。
   (3)  藥物輔助加溫處理 ----- 
         先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí)，可殺死支原體，但對(duì)細(xì)胞有不良影響。
  (4)  使用支原體特異性血清  
用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長(zhǎng)，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個(gè)月后仍為陰性。
但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì)。   

（四）污染的預(yù)防
預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生污染的最好辦法。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。  
 
一般預(yù)防可從以下幾方面著手：
1、添加抗生素
2、從物品、用品消毒滅菌著手 -----
     細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì)，并在無(wú)菌試驗(yàn)陰性后才能使用。操作室及剩余的無(wú)菌器材要定期清潔消毒滅菌。   
3、從操作者做起 -----
     (1)  進(jìn)無(wú)菌室前要用肥皂洗手，按規(guī)定穿隔離衣。工作開(kāi)始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。
     (2)  操作者動(dòng)作要輕，必須在火焰周圍無(wú)菌區(qū)內(nèi)打開(kāi)瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼。操作時(shí)盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。
     (3)  操作時(shí)要常更換吸管，一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢用消毒水浸泡的紗布擦臺(tái)面。
4、防止細(xì)胞交叉污染 -----
     (1)  在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分。 
    (2)  在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。   '
    (3)  細(xì)胞一旦購(gòu)置或從別處引入，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇培養(yǎng)。
5、無(wú)菌室的徹底消毒 -----
    (1)  0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無(wú)菌室；
   (2)  甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣休對(duì)各種細(xì)菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。
   (3)  細(xì)胞培養(yǎng)，首先要避免污染，但在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，有了污染用適當(dāng)?shù)姆椒ㄇ宄?，這樣也可以保證細(xì)胞培養(yǎng)的成功。