Zero Background pTOPO-Blunt Cloning Kit
零背景pTOPO-Blunt平末端克隆試劑盒
包裝規(guī)格：
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V6002-20
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Zero Background pTOPO-Blunt Cloning Kit
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20T*10μL
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620元
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V6002-60
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Zero Background pTOPO-Blunt Cloning Kit
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20T*10μL
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1660元
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產(chǎn)品介紹：
本制品和傳統(tǒng)的T4連接酶原理不同，它利用了Topoisomerase可以在瞬間（幾秒鐘-幾分鐘）、高效（接近100%）連接DNA片段的原理。
1. 可以在瞬間（幾秒鐘-幾分鐘）完成連接。
2. 無需冰浴和熱休克，室溫5分鐘內(nèi)完成轉化；無需1小時復蘇，只需37℃10分鐘復蘇便可以涂板。從連接到涂板只需15-20分鐘。
3. 無自連、零背景，無需繁瑣藍白斑篩選，見到長出的克隆便是有插入的（接近100%）。
4. 可以連接長達10kb片段（即使連接5kb片段，挑10個菌落，至少8個是有插入的），是
一種簡單、快速、零背景免篩選的TOPO 平末端克隆載體。
產(chǎn)品存儲：－20℃儲存，至少6個月內(nèi)不影響使用效果。
注：本TOPO載體連接體系是按照10ml計算，如果按照其它公司產(chǎn)品5ml計算，實際使用次數(shù)可以增加一倍，20次實際可用40次。
測序可以采用 M13F/M13R通用引物測序（見后面圖譜）
操作步驟：
1.連接反應的準備：
PCR引物不能磷酸化。使用擴增產(chǎn)物是平末端的高保真聚合酶系列擴增（如Pfu、Vent、Phusion DNA Polymerase）。 PCR產(chǎn)物（僅有目的條帶、無非特異條帶和引物二聚體）可直接進行連接反應，無需純化，否則建議膠回收純化（貨號：DR01)。如果是以質粒為模板的PCR產(chǎn)物則最好進行純化，因為模板質粒也可能長出菌落（但不是想構建的目的載體）。
2.連接反應：
1)室溫（20℃-30℃）按照如下體系操作（10ml體系）：
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純化后的PCR產(chǎn)物/或者1ul 1kb control
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0.5-8ul
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pTOPO-Blunt Vector
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1ul
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10 ′ Enhancer
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1ul
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滅菌水
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Xul
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總體積
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10ul
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加完試劑后，用移液器輕輕吹打混勻或者輕彈管底混勻，低速瞬時離心收集所有液體在離心管底，
注意此步驟不能在冰上進行，只能在室溫（20℃-30℃）進行。
注：如果使用5ml體系連接，各成分按照比例減半使用，使用次數(shù)可以加倍。
不同大小插入片段的推薦用量：
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插入片段大小（bp）
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最佳用量（ng）
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100-1000
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20-50
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1000-2000
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50-100
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2000-5000
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100-200
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2)室溫（20℃-30℃）連接5分鐘。
本載體推薦室溫5分鐘完成連接（不要超過5分鐘），但在很多情況下連接1-2分鐘已經(jīng)可以得到足夠多的轉化子。
3)連接產(chǎn)物可直接轉化感受態(tài)細胞或貯存于-20℃。
如尚未準備好感受態(tài)細胞，可以將連接產(chǎn)物短時間置于冰上備用。
3.轉化：
1)50-100ml感受態(tài)細胞，置于室溫解凍，完全解凍后（約1分鐘左右）輕撣幾次將細胞均勻懸浮。
2)加入5ml連接液(最多可全部加入，只要體積不超過感受態(tài)細胞體積的1/10)，輕輕混勻，室溫放置5分鐘。
根據(jù)我們的經(jīng)驗，本公司載體使用商品化的感受態(tài)細胞不需要冰浴和熱休克、室溫放置5分鐘便可獲得足夠多轉化子，如果實驗室自制感受態(tài)細胞或者效率較低時，可以按照標準程序進行。
3)加300-500ml LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)10分鐘。
根據(jù)我們的經(jīng)驗，一般可以直接將培養(yǎng)基（事先平衡至室溫） 加入感受態(tài)細胞的1.5 ml 離心管，蓋上離心管蓋，水平固定在振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)復蘇即可，不需要轉移到試管培養(yǎng)復蘇。
一般商品化的感受態(tài)細胞不超過2kb插入片段情況下，10分鐘復蘇可以得到足夠多轉化子，如果使用實驗室自制的感受態(tài)或者插入片段長轉化子少的情況下可以提高復蘇時間到30-60分鐘以得到更多的轉化子。
4)取200ml菌液涂板，培養(yǎng)過夜（如果預計轉化子少，為得到較多克隆，4000 rpm 離心1 min，吸棄掉部分上清，保留100-150ml，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）
4.轉化子的篩選鑒定：
本制品陽性率相當高，一般情況下，可以達到所見即所得，只要是長出來的菌落正常（不是污染的雜菌，轉化子數(shù)量也不算太少），基本就包含插入。因此插入片段不超過2-3kb的情況下可以不用鑒定直接挑1-2個菌去測序。
1).用上述培養(yǎng)的白色菌落的菌液抽提質粒，插入片段較大的情況下，直接跑電泳看質粒大小就直接能鑒定出有插入的質粒，還可用EcoR I/Ecor V雙酶切釋放插入片段或用其它合適的酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定是否含有目的片段。
2).挑取菌落直接進行PCR檢測（可參見分子克隆第3版本或者咨詢我們）。
3).用通用M13F/M13R引物測序來確定是否含有目的克隆。
pTOPO-Blunt載體圖譜：
pTOPO-Blunt載體通用測序引物序列：
M13F: TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R: CAGGAAACAGCTATGACC
pTOPO-Blunt載體多克隆位點序列：
