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nfo DNA恒溫快速擴增試劑盒(試紙條型)

包裝規(guī)格：

用于DNA擴增，試紙條檢測

配套使用產品：

一. 原理概述：
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點形成D-loop區(qū)域，并開始對DNA雙鏈進行掃描；待找到與引物互補的目的區(qū)域后，復合體Rec/ssDNA解體的同時，聚合酶也結合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。依賴nfo酶的作用，加入根據模版設計的特異的分子探針，使用膠體金技術（三明治夾心法）可以對最終結果進行檢測。

二. 產品特點：
本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應時間短（僅需12 mins）等優(yōu)點，反應組分為干粉狀態(tài)，操作簡便，易于保存。
本試劑對設備要求低，金屬浴、水浴鍋等即可進行反應操作，無需購買PCR擴增儀等價格高昂的專屬設備。

三. 引物設計：
1. 建議使用長度在 30-35 bp的引物，引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度；

2. 堿基排布隨機性高，GC 含量在 30%-70%之間；

3. 下游引物的5’端標記一個修飾基團（常用生物素Biotin）；

4. 引物設計避免形成二級結構而影響擴增；

5. 擴增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。

四. 熒光探針設計：
在上下游引物中間，設計一段長度為 46-52nt 與目的片段互補的序列作為膠體金探針；
探針序列不與特異性引物識別位點重疊，長度為 46-52 nt，序列避免回文序列、內部二級結構和連續(xù)的重復堿基。

探針共有三個修飾位點：
1. 5’端修飾一個抗原標記（FAM）；
2. 在距 5’端約 30nt 序列位置上標記一個 dSpacer（四氫呋喃，THF），作為 nfo 的識別位點；
3. THF 距離 3’末端約 15 nt，并且 3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或 C3-spacer。

提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。
1).每個干粉反應管加入32.9 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混勻，否則會對實驗效果產生影響）；

2).每個反應管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對于多個反應、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應管中）；

3).向反應管中依次加入5 μL ddH2O和5 μL核酸模板（可根據核酸濃度調整加入的核酸模板體積，并相應調整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為10 μL）；

4).最后向反應管中加入2.5 μL B Buffer并充分混合（對于多個反應，建議將B Buffer加至反應管的蓋子內側，上下顛倒反應管8-10次混勻）；

5).混勻后，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應管放入恒溫設備中37-39 oC孵育8-12 mins；

6).反應結束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的離心管中，混合均勻后，吸取 50uL稀釋的產物滴加在膠體金卡點樣孔中3-5 mins，觀察質控線與檢測線判讀結果。

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